上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，主要經(jīng)營elisa試劑盒，生物試劑，標(biāo)準(zhǔn)品，血清，抗體，培養(yǎng)基，細(xì)胞，歡迎各位前來咨詢。
一、實驗原理
Lederberg和Tatum（1946）選用典型的大腸桿菌為材料，篩選營養(yǎng)缺陷型。利用雙重和三重缺陷型的菌株，在簡單的合成培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)，在此培養(yǎng)基上只有重組子能長，親本不能長，即所謂選擇性培養(yǎng)，使細(xì)菌雜交獲得成功。圖12-1說明了細(xì)菌的基因重組是不同基因型的細(xì)菌經(jīng)接觸，接合后隨之發(fā)生交換和雜種細(xì)菌分離的過程。
大腸桿菌的雜交試驗中發(fā)現(xiàn)有些菌株經(jīng)混合培養(yǎng)能得到重組子，有些卻不能。1952年Hayes做了一個實驗，他所用的二個菌株是菌株A和菌株B。菌株A是不能合成甲硫氨酸和生物素；菌株B是蘇氨酸、亮氨酸和維生素B1的三重缺陷型。Hayes首先篩選鏈霉素抗性突變型ASr和BSr，然后在不含鏈霉素的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行正反雜交，結(jié)果沒有不同，但在含鏈霉素的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行正反雜交，結(jié)果卻不一樣，在ASs×BSr雜交中能得到重組子，可是ASr×BSs雜交中卻并不出現(xiàn)重組菌落。這一現(xiàn)象說明大腸桿菌中有不同的“性”，它與致育因子F有關(guān)。同時按細(xì)胞中有無F因子將大腸桿菌分為二類，有F因子的為F+，沒有F因子為F-。F因子是一個小的DNA環(huán)狀分子，分子量約4.5×106道爾頓。帶有F因子的細(xì)胞，表面有一種稱為性菌毛的毛狀突起，長約1至20μ。性菌毛上有雄性專一噬菌體（MS2、k17、f2、Qβ等）的吸附位點，又和細(xì)胞的接合有關(guān)。F因子在細(xì)胞中能以二種狀態(tài)存在；游離狀態(tài)和整合到寄主染色體的一定位置。以致帶有F因子的大腸桿菌可分為二類：F+和Hfr菌株。經(jīng)吖啶橙處理F+變?yōu)镕-，而Hfr性質(zhì)不變，說明F因子在F+菌株中呈游離狀態(tài)，而在Hfr菌株中則整合到寄主染色體的一定位置（圖12-2）。
大腸桿菌雜交在F+與F-菌株之間進(jìn)行，通過細(xì)胞的暫時溝通，形成局部合子。在部分合子的形成中，提供部分染色體或少數(shù)基因的菌稱為供體菌，提供整個染色體的菌稱為受體菌；所以F+和Hfr是供體細(xì)菌，F(xiàn)-是受體菌。F+和F-能雜交，Hfr和F-也能雜交，F(xiàn)-和F-則不能雜交；但這二個可雜交組合其特性不同，主要表現(xiàn)在：1.Hfr細(xì)菌和F-細(xì)菌雜交以后F-細(xì)菌性質(zhì)不變，F(xiàn)+和F-細(xì)菌雜交以后F-細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)镕+（約70％）。2.F+和F-細(xì)菌雜交重組頻率10-6，Hfr和F-細(xì)菌雜交重組頻率高出F+菌株幾百倍，稱高頻重組。
在F+與F-雜交中，F(xiàn)因子由F+供體高頻轉(zhuǎn)移到F-受體，低頻轉(zhuǎn)移宿主染色體的標(biāo)志。原因是F+群體中每個細(xì)胞能轉(zhuǎn)移性因子到F-受體，只有小部分細(xì)胞能轉(zhuǎn)移染色體的標(biāo)記。在Hfr與F-雜交中，Hfr供體的染色體由原點（在F因子內(nèi)）開始轉(zhuǎn)移進(jìn)入受體菌，在這過程中F因子被割裂，F(xiàn)因子基因，一些是首入，另一些是*后進(jìn)入。在這類雜交中只有當(dāng)交配過程長到足以允許整個供體染色體被轉(zhuǎn)移入F-受體，受體細(xì)胞才能由F-變?yōu)镠fr。
雜交實驗有多種不同方法，這里介紹的是直接混合培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。直接混合培養(yǎng)法操作簡單，適用于確定二個菌株間能否雜交或測定重組頻率的高低，而液體培養(yǎng)適宜于細(xì)菌的基因定位。
二、實驗材料
大腸桿菌（EscherichiacoliK12）的四個菌株：K12Pro（λ）F+；W1485HisIleF+；W1177ThrLeuthixylGalaramtl mallacstrr（λ）F-；HfrCMetTrp。
Pro：脯氨酸，（λ）：原噬菌體整合在染色體上，His：組氨酸，ilv：異亮氨酸纈氨酸，Thr：蘇氨酸，Leu：亮氨酸，thi：維生素B1，xyl：木糖，Gal：半乳糖，ara：阿拉伯糖，mtl：甘露醇，mal：麥芽糖，lac：乳糖，strr：鏈霉素抗性，Met：甲硫氨酸，Trp：色氨酸。
三、實驗器具和藥品
1.用具：滅菌培養(yǎng)皿（9厘米），滅菌三角瓶（150毫升），滅菌吸管（1、5、10毫升），滅菌離心管，滅菌空試管。
2.培養(yǎng)基：
（1）基本培養(yǎng)基Vogel50×*：MgSO4·7H2O10克，檸檬酸100克，NaNH4HPO4·4H2O175克，K2HPO4500克（K2HPO4·3H2O644克），蒸餾水約1，000毫升**（配好后放入冰箱保存?zhèn)溆茫?/font>
（2）平板用基本培養(yǎng)基：Vogel50×2毫升，葡萄糖2克，瓊脂2克***，蒸餾水98毫升，pH7.0，高壓滅菌8磅/英寸230分鐘。
（3）液體完全培養(yǎng)基（肉湯培養(yǎng)基）：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸餾水100毫升，pH7.2，高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。
（4）半固體培養(yǎng)基：瓊脂0.7—1克，蒸餾水100毫升，pH7.0，高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。
四、實驗說明
大腸桿菌中除了不同型細(xì)胞的接合外，同型細(xì)胞F+與F+或*即濃度為使用濃度的50倍。
**將稱好的藥品分別溶解于670毫升蒸餾水中，待一種藥品溶解后再放另一種藥品，直至全部藥品都溶解，然后加水定容到1.000毫升。
***瓊脂的添加量由1.5—2克，根據(jù)瓊脂的質(zhì)量而定。凝固性能好的瓊脂，可少加一些，反之，則要多加一些。Hfr與Hfr也能接合，但重組頻率很低。細(xì)胞中的F因子使細(xì)胞壁的抗原發(fā)生了變化，這些不同于F性菌毛的表面成分阻止了F+與F+細(xì)胞雜交。經(jīng)培養(yǎng)后處于饑餓條件下的F+細(xì)胞喪失了它們的表面排斥性，才能與其它F+細(xì)胞接合（這種改變是暫時的，一旦在新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)生長正常的表面特性又恢復(fù)），這些表型上的“F-細(xì)胞”稱為擬表型。在抑制新的F性菌毛和表面成分形成的條件下生長，如低溫下連續(xù)通氣培養(yǎng)24—48小時，能增加擬表型的百分?jǐn)?shù)。
1946年Lederberg和Tatum開始發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的接合以后，普遍認(rèn)為DNA的轉(zhuǎn)移必需F+（Hfr）與F-細(xì)胞的緊密接觸。Anderson等于1957年根據(jù)電鏡照片指出接合細(xì)胞之間形成了橋。之后發(fā)現(xiàn)F+（Hfr）和性菌毛之間的關(guān)系，認(rèn)為細(xì)菌染色體和專一雄性噬菌體通過性菌毛而轉(zhuǎn)移。近來的電鏡照片已經(jīng)發(fā)現(xiàn)接合細(xì)胞通過性菌毛接觸，并有實驗依據(jù)。細(xì)胞接合后，供體中的DNA開始合成。一個單鏈DNA轉(zhuǎn)移入受體并合成一條新的互補(bǔ)鏈；這過程能以DNA復(fù)制的滾環(huán)模型來說明。
上面提到帶有F因子的大腸桿菌有F+和Hfr二類，實際上并不是所有的Hfr全是相當(dāng)穩(wěn)定的，在許多Hfr群體中含有回復(fù)子，在這些回復(fù)子中F因子不再整合在染色體上，而回復(fù)到游離狀態(tài)，當(dāng)F因子脫離寄主染色體時攜帶了細(xì)菌的基因，例如lac和gal等，這稱之為F′因子。帶有F′因子的菌稱為F′菌株。F′菌株也能與F-雜交，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的研究工作。
五、實驗步驟
1.菌液制備：
（1）實驗前14—16小時，從冰箱保存的斜面菌種，挑少量菌于盛有5毫升完全液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中；每一個菌株接種一瓶，共接種4瓶，置37℃培養(yǎng)過夜。
（2）取出培養(yǎng)過夜的細(xì)菌，在W1177一瓶菌液中加入5毫升新鮮的完全培養(yǎng)液，充分搖勻，等量分成2瓶；其余3瓶菌液分別用滅菌的5毫升吸管，各吸出2.5毫升菌液，然后再各加入2.5毫升新鮮的完全培養(yǎng)液，充分搖勻，各菌于37℃繼續(xù)培養(yǎng)3—5小時。
（3）自溫箱取出三角燒瓶，分別倒入離心管，菌株W1177倒二支離心管，其余菌株各倒入一支離心管，離心沉淀，3，500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。
（4）倒去上清液，打勻沉淀，加入無菌水，離心洗滌3次，再加無菌水到原體積。
2.雜交——混合培養(yǎng)：
（1）取12支滅菌試管，每支吸入3毫升經(jīng)融化的半固體培養(yǎng)基，并保溫在45℃（保溫溫度不宜高，北方氣溫低，可降低半固體中的瓊脂量）。
（2）12支試管分成三個雜交組合，即W1177×K12pro；W1177×W1485；W1177×HfrC。每個組合各4支試管，其中2支對照，2支混合菌液。
（3）對照組試管各吸F+或Hfr供體菌菌液1毫升，其余按雜交組合各吸供體菌和受體菌菌液0.5毫升，充分混勻。
（4）將各試管中含菌的半固體倒在有Vogel培養(yǎng)基底層的平板上，搖勻待凝，放37℃培養(yǎng)，48小時后觀察（圖12－3）。
六、實驗結(jié)果記錄
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
總訪問量：7932165 管理登錄
