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ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題分析

點(diǎn)擊次數(shù)：13354 發(fā)布時(shí)間：2012/11/12 17:47:03

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ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題分析

異常	結(jié)果描述	原因分析	對(duì)策
白板	顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)板所有孔均無顏色。陽性對(duì)照不顯色。	試劑已過效期，或不同試劑盒組分混用	檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)未過期以及所有組分均屬對(duì)應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑不能混用。
		錯(cuò)加、漏加試劑底物、顯色劑 A或B	嚴(yán)格按說明書的步驟操作，加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現(xiàn)象。
		洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力	確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈。
		終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜锞彌_液配制	每次配制時(shí)都應(yīng)看清標(biāo)簽標(biāo)明物質(zhì)
		蒸餾水有問題	確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未污染，與好蒸餾水比較。
顯色弱、靈敏度低	實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，包括陽性對(duì)照、質(zhì)控在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡。	試劑盒超過期，超過有效期的產(chǎn)品可能會(huì)產(chǎn)生很弱的信號(hào)；試劑盒沒有按規(guī)定進(jìn)行保存，受高溫影響；	實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)試劑未過期。不要將試劑盒長(zhǎng)時(shí)間置于常溫下，按使用規(guī)定儲(chǔ)藏。
		試劑、樣品用前未平衡至室溫	從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應(yīng)置室溫平衡 20分鐘左右。
		加入試劑的體積和時(shí)間有誤，移液器計(jì)量不準(zhǔn)，吸嘴內(nèi)水分太多或不清潔；	確定所使用的試劑體積正確，加入時(shí)間適當(dāng)。校正移液器，移液器與吸嘴配合要緊密吻合。移液不宜太快，排放應(yīng)完全。
		洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力	確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈，確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未受污染。
		孵育時(shí)間及孵育溫度未達(dá)到要求，反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱時(shí)注意溫度并及時(shí)調(diào)整。	孵育溫度應(yīng)控制在 37-38℃，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說明書操作。保溫期內(nèi)不宜多開門，以免影響保溫。
		洗板次數(shù)過多，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求；洗滌沖擊力太大。浸泡時(shí)間太長(zhǎng)；	嚴(yán)格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，減小洗滌沖擊力，按說明書要求置留洗滌液時(shí)間和洗滌次數(shù)。
		顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入；	顯色劑滴瓶垂直向下，持力均勻，滴速不宜過快，先加顯色劑 A，后加顯色劑B，不可將A、B液混合后加入
		底物作用時(shí)間不夠；	準(zhǔn)確定時(shí)。
		蒸餾水水質(zhì)有問題；	測(cè)定蒸餾水配制試劑對(duì)酶免疫法的影響。
	實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，陰陽性對(duì)照正常，質(zhì)控正常，但臨床標(biāo)本感覺顯色較弱	待測(cè)標(biāo)本中可能不含強(qiáng)陽性標(biāo)本，故結(jié)果可能是正常的	如有懷疑，可復(fù)檢
		標(biāo)本加入疊氮鈉作為防腐劑	酶免實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用 proclin、硫柳汞等其他防腐劑
	陰陽性對(duì)照正常，但質(zhì)控、參考品或個(gè)別弱陽性標(biāo)本未能檢出。	未達(dá)要求的孵育溫度及孵育時(shí)間可檢出強(qiáng)陽性標(biāo)本，但質(zhì)控或弱陽性標(biāo)本受溫度變化影響較大而被未檢出	質(zhì)控品或標(biāo)本避免反復(fù)凍融。標(biāo)本在一周內(nèi)使用的，可存于 2-8℃，如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于-20℃以下保存。質(zhì)控品應(yīng)小量分裝，并置于-20℃以下保存。
		質(zhì)控品或標(biāo)本高溫放置過久，或被反復(fù)凍融致待測(cè)物滴度下降，而未能檢出	重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配。
		儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配	重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配
靈敏度過高、板底高、高背景	終止后，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或陰陽性對(duì)照、質(zhì)控正常，標(biāo)本陰性標(biāo)本 OD值過高。	整板的黃板現(xiàn)象可能是由于錯(cuò)加其他試劑造成，如同時(shí)操作兩對(duì)半試劑時(shí)，測(cè) HbsAb板用于測(cè)HBsAg等；	實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)所有組分均屬于對(duì)應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑不能混用
		酶標(biāo)對(duì)吸頭的污染以及對(duì)盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現(xiàn)象；	避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈
		顯色劑在光照條件下放置過久，實(shí)驗(yàn)前已變藍(lán)	顯色劑 A、B未使用前避光保存
		孵育溫度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)；	孵育溫度應(yīng)控制在 37-38℃，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說明書操作。
		未按要求洗板。特別是洗滌時(shí)每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現(xiàn)象	嚴(yán)格按說明書要求洗板
		花板，一般是由于臨床標(biāo)本的收集、處理和保存方法不當(dāng)造成	放置時(shí)間（自然放置 1~2h）及離心轉(zhuǎn)速（3000r/min）、離心時(shí)間（15min）應(yīng)引起注意。
	出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象	樣品離心不完全，反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分；	充分離心， 3000rpm6分鐘以上。
		加樣時(shí)交叉污染；	加標(biāo)本時(shí)盡量避免交叉污染。如盛標(biāo)本的試管周圍常有血痂，易脫落，應(yīng)遠(yuǎn)離酶標(biāo)板。
		手工洗板造成的交叉污染	手工洗板時(shí)前 3次注洗液后應(yīng)立即棄去，后幾次再設(shè)定浸泡時(shí)間，可減少交叉污染
		洗板機(jī)加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔	疏通加液頭，使洗板時(shí)每孔均注滿洗液，吸液時(shí)殘留量要小。
		拍板時(shí)交叉污染	洗板完畢拍板時(shí)用合適的吸水紙巾，不要把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔，并盡量不要在同位置拍，以免交叉污染。
假陽性	假陽性現(xiàn)象是一個(gè)綜合現(xiàn)象，可參考上文 “靈敏度過高、板底高、高背景” 中的分析。這里只列舉常見的原因及對(duì)策。	計(jì)算 Cutoff值時(shí)使用的公式不正確，導(dǎo)致計(jì)算得出的CutOff值過低，從而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性	CutOff值計(jì)算公式應(yīng)嚴(yán)格參照所屬產(chǎn)品的說明書，應(yīng)注意各個(gè)酶免產(chǎn)品的Cutoff值計(jì)算公式不盡相同
		洗板時(shí)未能注滿洗液或洗板次數(shù)、浸泡時(shí)間不夠，洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留導(dǎo)致花板、跳孔，假陽性增多	嚴(yán)格按說明書要求洗板。調(diào)整洗板機(jī)時(shí)，應(yīng)注意有時(shí)儀器標(biāo)示的液量與實(shí)際液量并不相符，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整至每孔注滿。
		血清標(biāo)本處理不當(dāng)，如未除去細(xì)胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物可出現(xiàn)孔底由變藍(lán)的跳孔現(xiàn)象，此標(biāo)本重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往是陰性；	放置時(shí)間（自然放置 1~2h）及離心轉(zhuǎn)速（3000r/min）、離心時(shí)間（15min）應(yīng)引起注意
		廠家試劑質(zhì)量的變化造成	國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求提高靈敏度時(shí)，廠家試劑靈敏度也相應(yīng)提高，假陽率常常有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的
		水質(zhì)問題	防止蒸餾水污染
		加酶量過多（如 50uL誤認(rèn)為100uL）或丙肝酶稀釋時(shí)加量過多	加酶前檢查移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確，稀釋酶時(shí)思想要集中
		培養(yǎng)箱溫度超過 37℃或酶結(jié)合物反應(yīng)時(shí)間或底物顯色時(shí)間超過	放入板以前要檢查培養(yǎng)箱的溫度，準(zhǔn)確定時(shí)
		底物配制時(shí)間過長(zhǎng)、或底物污染	底物應(yīng)在酶反應(yīng)完畢即將洗滌前 5分鐘配制，注意避光
		該批樣品放置時(shí)間過長(zhǎng)，樣品污染	樣品應(yīng)保持新鮮，或低溫保存，防止污染
		移液嘴重復(fù)使用，未洗凈或消毒不完全而用于加酶或底物	移液嘴盡可能一次性使用
重復(fù)性差		1、樣品數(shù)量不一，加樣時(shí)間長(zhǎng)短不一	重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與次接近
		2、樣品加入后未混勻	加樣后在混勻器上充分混勻
		3、酶標(biāo)儀濾光片不對(duì)或輸入波長(zhǎng)不對(duì)	TMB顯色用450/630波長(zhǎng)
		4、酶標(biāo)儀測(cè)定重復(fù)性差	校對(duì)酶標(biāo)儀
		5、洗滌不正確	洗滌液注滿各孔但不要溢出。洗板時(shí)反應(yīng)板面向下，垂直用力甩凈內(nèi)容物（可多甩幾次），在干凈、無或少塵的吸水材料上拍干。洗板機(jī)洗板時(shí)不應(yīng)有堵孔，洗滌應(yīng)充分
		6、溫育條件不一致（一次用水育，一次用恒溫箱）	恒溫箱溫育較水浴顯色深， OD值高出0.1-0.15,均采用恒溫箱.如用水浴水溫應(yīng)控制在37℃
		7、不慎多加或少加酶或顯色劑	多加時(shí)顯色深，少加則淺，用記號(hào)筆圈上，便于分析
		8、閾值附近時(shí)陰時(shí)陽	同一樣品做三個(gè)復(fù)孔，以二個(gè)（含二個(gè)以上相同結(jié)果為準(zhǔn)）
		9、加樣量不足、保溫時(shí)間、洗滌條件一致	盡可能使用同一移液器和裝緊吸嘴重復(fù)測(cè)定標(biāo)本。條件、人員等應(yīng)盡量與上次保持一致