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點(diǎn)擊次數(shù):13309 發(fā)布時(shí)間:2013/8/26 9:34:39
【試劑盒組成】 【保存條件】 【操作程序】 3 擴(kuò)增反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備: 3.4 在冰上溶解試劑,并輕輕扣擊充分混合 (不要旋渦振蕩含酶的試劑) 4 反應(yīng)的準(zhǔn)備 5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 備注:
25 管 擴(kuò)增反應(yīng)試劑球 (Reagent Sphere; 4℃ 保存)
2 x 520 μl AIV 擴(kuò)增反應(yīng)試劑球溶液 (Sphere Diluent; -20℃ 保存)
2 x 25 μl 陽(yáng)性對(duì)照 (Positive control; -20℃ 保存)
試劑球需置干燥劑中保存在4℃,已融解的試劑球則需保存在零下20℃。其他試劑亦需保存在零下20℃。使用前在冰上溶解各試劑并充分混合,不要旋渦振蕩含酶的擴(kuò)增反應(yīng)試劑。
1 樣本采集、存放及運(yùn)輸
1.1 樣本采集:
所用取樣器材必須經(jīng)高壓或干熱滅菌。
若樣品為活禽,建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子:取咽喉拭子時(shí)將拭子深入喉頭口及上顎裂來(lái)回刮幾次取咽喉分泌液,取泄殖腔拭子時(shí)將拭子深入瀉殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2ml PBS(含抗菌素)的試管,充分洗滌拭子,然后在管壁擠干液體,轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用。
若樣品為新鮮肌肉或臟器,取待檢樣品2g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨,加10ml PBS混勻,取上清轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用。為使樣品的代表性更強(qiáng),也可取50克肉樣,加入50ml無(wú)菌的PBS液,用Bagmixer均質(zhì)器處理后,取上清備用。
若樣品為血清、血漿或冷凍組織滲出液,則直接取用。
1.2 存放:
分離后的樣本在2℃—8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24hr; -70℃以下可長(zhǎng)期保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融(*多凍融3次)。
1.3 運(yùn)輸:
采用或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
2 樣本處理:
2.1 取n個(gè)1.5ml滅菌離心管(n = 樣本數(shù)+ 1管陰性對(duì)照+ 1管陽(yáng)性對(duì)照),作好標(biāo)記。
2.2 首先加入600ul裂解液(裂解液即提取液,有很強(qiáng)的腐蝕性,切勿沾到皮膚或衣物,否則立即用大量清水沖洗并擦干),然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200ul(一份樣本換用一個(gè)吸頭);再加入200ul氯仿,混勻器上振蕩混勻5sec(不宜過(guò)于強(qiáng)烈,以免產(chǎn)生乳化層,也可用手顛倒混勻)。
2.3 于12,000g離心15min(如有條件,于4℃進(jìn)行離心)。
2.4 取與步驟2.1.1中相同數(shù)量的1.5ml滅菌離心管,加入400ul異丙醇(-20℃預(yù)冷),作好標(biāo)記。吸取步驟2.1.3各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中(上清液應(yīng)至少吸取500ul,注意不要吸出中間層,該層富含DNA和蛋白質(zhì)),顛倒混勻。
2.5 12,000g離心15min,(注意固定離心管方向,即將離心管開口朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)。輕輕倒去上清,倒置于吸水紙上,沾干液體(不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干);加入600ul 75%乙醇(-20℃預(yù)冷),顛倒洗滌。
2.6 12,000g離心10min,(注意固定離心管方向,即將離心管開口朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)。輕輕倒去上清,倒置于吸水紙上,盡量沾干液體(不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)。
2.7 4,000g離心10sec(注意固定離心管方向,即將離心管開口朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)將管壁上的殘余液體甩到管底部,用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換用一個(gè)吸頭,注意吸頭不要碰到有沉淀一面),室溫干燥5-10min(不宜過(guò)于干燥,以免RNA不溶)。
2.8 加入11ul DEPC水,輕輕混勻,溶解管壁上的RNA,2,000g離心5sec,冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁猓捍藭r(shí)的RNA*易受RNA酶降解,請(qǐng)?jiān)?小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增)。
3.1 計(jì)算所需的反應(yīng)數(shù)量 (n)
3.2 需要溶解的試劑球 = 0.5 x n
3.3 每個(gè)試劑球需要 40 μl 試劑球溶液
4.1 實(shí)驗(yàn)中除從樣本中獲得的RNA 模板外,我們還建議設(shè)置陽(yáng)性和陰性(水)對(duì)照
4.2 按照下表準(zhǔn)備擴(kuò)增反應(yīng)試劑:
反應(yīng)組分--每個(gè)反應(yīng)體積
擴(kuò)增反應(yīng)試劑 20 μl
樣品RNA 5 μl
總體積 25 μl
注意:實(shí)驗(yàn)時(shí) RNA 應(yīng)放在冰上,陽(yáng)性對(duì)照建議加5 μl 試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照。建議PCR 過(guò)程中檢測(cè)樣本設(shè)置重復(fù),以便得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了驗(yàn)證陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是由于樣本中存有PCR 抑制物而導(dǎo)致PCR 呈陰性反應(yīng),我們建議在測(cè)試樣本中加1 μl 的陽(yáng)性對(duì)照作為spiking 對(duì)照(spiking control),同時(shí)進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
PCR 循環(huán):
1 個(gè)循環(huán) 42℃ 30 分鐘
95℃ 10 分鐘
40 個(gè)循環(huán) 95℃ 30 秒
53℃ 30 秒
72℃ 30 秒
PCR 的產(chǎn)物需要通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
產(chǎn)物長(zhǎng)度 : 246 bp
Spiking 對(duì)照陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有幾個(gè)可能性: 樣本中不存在目的片段;樣本中目的片段的量低于檢測(cè)值;
【樣本中存有 PCR 抑制物】
試劑盒中設(shè)計(jì)spiking 對(duì)照 (spiking control) 是為了確定沒(méi)有發(fā)生PCR 抑制。如果樣本中加了陽(yáng)性對(duì)照以后得出陰性結(jié)果,說(shuō)明樣本中存在PCR 抑制物,那幺此次陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不能作為正確的結(jié)果,需要重新開始樣本核酸的提取和PCR 擴(kuò)增。
對(duì)于禽流感檢測(cè)樣本的獲得和前處理,可以參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“高致病性禽流感診斷技術(shù)(GB/T 18936-2003)”推薦的方法進(jìn)行,具體為:
【病料的采集】死禽采集氣管、脾、肺、肝、腎和腦等組織樣品,進(jìn)行分別處理或者同時(shí)處理;活禽病料應(yīng)包括氣管或泄殖腔拭子,尤其以采集氣管拭子更好;小珍禽用拭子取樣易造成損傷,可采集新鮮新鮮糞便。
禽流感病毒H1- H15通用型PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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