活體光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）技術(shù)與熒光（fluorescence）技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標記細胞或DNA，今天，生物發(fā)光標記物可以標記到任何一種基因上，使對基因功能的全面細致研究成為現(xiàn)實。而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（GFP、RFP，Cyt及dyes等）進行標記，利用熒光蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測信號。研究人員能夠利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。

    該技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于標記細胞或基因的示蹤及檢測；基因治療(gene therapy)在活體動物體內(nèi)直接的觀察和檢測；基因組、蛋白組學(xué)、藥學(xué)及生物技術(shù)在活體動物內(nèi)的研究；藥物及化學(xué)合成藥物的藥物代謝及毒理學(xué)監(jiān)測；食品菌落生長成像；皮膚醫(yī)學(xué)中皮膚疾病的體內(nèi)成像；法醫(yī)鑒定；微孔板成像，例如：免疫分析、報告基因、基因探針和嗜菌作用分析等；熒光團的體內(nèi)成像，例如：Alzheimer疾病研究中結(jié)合嗪的β-淀粉沉淀物分析；轉(zhuǎn)基因植物(transgenic plant)中通過報告基因?qū)ι�理周期�?jié)奏的研究；凝膠成像分析等等。

    實驗步驟

    1. 用熒光色素DiD標記間充質(zhì)干細胞

    1) 先用胰蛋白酶消化待標記材料，使之成為一定密度的懸浮液；

    2) 從細胞培養(yǎng)箱中取出間充質(zhì)干細胞，吸取含原有培養(yǎng)基的細胞懸浮液進行標記；

    3) 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含鈣鎂離子的磷酸緩沖液）清洗細胞，吸去PBS，鈣鎂離子會影響胰蛋白酶的活性，必須小心；

    4) 加入預(yù)熱的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶為例，每瓶加5ml，確保瓶的表面被完全覆蓋；

    5) 在細胞培養(yǎng)箱中37° C 孵育約 5 分鐘；

    6) 然后在顯微鏡下確認細胞已經(jīng)完全分散，如果有細胞貼壁情況，輕拍若干次或延長孵育時間直至酶解消化完全成功；

    7) 加入等量含 10% FCS的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶；

    8) 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細胞均勻分散；

    9) 然后移取細胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；

    10) 400 RCF離心5 分鐘；

    11) 小心移去上清液，不要擾動細胞；

    12) 將細胞重新懸浮于DMEM 并進行計數(shù)；

    13) 需要待標記細胞在無血清DMEM溶液中的密度應(yīng)為1x106/ml ；

    14) 每ml細胞懸浮液加入5 μL DiD 染色液；

    15) 用移液器將染色液與細胞懸浮液混合均勻；

    16) 在6孔低附著性細胞板上37°C 孵育20分鐘；

    17) 孵育完全后移取細胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；

    18) 400 RCF離心5 分鐘；

    19) 小心移去染色液，不要擾動細胞；

    20) 用PBS清洗細胞，用移液器反復(fù)吸取幾次確保細胞均勻分散；

    21) 重復(fù)洗三次；

    22) 細胞重新計數(shù)并用臺盼藍染色法檢測細胞活性；

    23) 進行活細胞成像。

    2. 用熒光色素ICG標記人胚胎干細胞

    1) 必須先準備好吲哚菁綠溶液（血容量、心輸出量、肝功能測定劑）作為對照品，然后使之與轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白（抗凝血作用）混合；

    2) 測出1ml吲哚菁綠溶液的活力，然后在100 μL DMSO中溶解ICG；

    3) 向混合物中加入 400 μL Dulbecco的改良Eagles 培養(yǎng)基 (DMEM加10% 胎牛血清)，震蕩均勻，吲哚菁綠溶液終濃度為2mg/ml；

    4) 加入轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白，魚精蛋白作為對照品的載體，使之能夠有效進入細胞；

    5) 在300 μL ICG 和 300 μL 無血清Dulbecco改良 Eagles 培養(yǎng)基中混入 5 μL 硫酸魚精蛋白溶液，使之終濃度為 10mg/ml，；

    6) 震蕩5分鐘使之形成復(fù)合物，標記溶液制備完畢；

    7) 從 hESC 10mm Petri 培養(yǎng)皿中移去原有培養(yǎng)基；

    8) 加入5ml預(yù)熱的 DMEM；

    9) 加入制備好的魚精蛋白/ICG 溶液， 37°C下孵育1h；

    10) 孵育完全后移去染色液；

    11) 用5 ml PBS漂洗培養(yǎng)皿以清除染色液；

    12) 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37°C下孵育5分鐘使之酶解，適當震搖培養(yǎng)皿效果會更好；

    13) 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細胞均勻分散；

    14) 加入等量含 10% KSR的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶；

    15) 然后移取細胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中，400 RCF離心5 分鐘；

    16) 在全培養(yǎng)基中懸浮細胞；

    17) 如果還有細胞團塊，可以移去原有培養(yǎng)基用10ml預(yù)熱的全ESC培養(yǎng)基重新懸浮細胞，重復(fù)酶解再離心；

    18) 在這一點上，鼠源飼喂細胞需從hESCs中分離；

    19) 然后將細胞懸浮液移至涂布瓊脂的10 cm 培養(yǎng)皿中；

    20) 37°C 孵育 45 分鐘，注意不要晃動培養(yǎng)皿，如此鼠源飼喂細胞會貼壁而干細胞保持懸��；

    21) 從Petri 培養(yǎng)皿中移出已標記的單細胞人胚胎干細胞懸浮液；

    22) 細胞重新計數(shù)并用臺盼藍染色法檢測細胞活性；

    23) 進行活細胞成像。

原創(chuàng)作者：上海恒遠生物科技有限公司